Есть почти все компании, которые продалипорошок фермента бромелайнсмешивается с папаином. Бромелайн трудно очистить до 5000GDU/г. но очень легко очистить папаин до 1000,000GDU/г. даже до 2000 000GDU/г. но функции бромелайна отличаются от папаина. цвет, запах, растворимость в воде и вкус контрастируют с поддельным продуктом и настоящим продуктом. Они отличаются тем, что правильный порошок фермента бромелайна серый, без запаха, без вкуса и нерастворим в воде.
А вот ложный бромелаин имеет следующие особенности:
● Светло-желтый, ароматный, слегка сладкий, растворимый в воде. Это свойство папаина.
● Он используется для уменьшения воспаления и облегчения боли. но в папаине этих функций почти нет.
● Он используется только как пищевая добавка, а не пищевая добавка, но действительно может быть фармацевтическим. Но папаин используется только в качестве порошка для размягчения мяса и косметики.
Мы протестировали бромелайн в соответствии с методами геля SDS-PAGE и GELATIN DIGESTION UNIT ANALYTICAL и HPLC, в гелевом методе SDS-PAGE меньше молекул-мишеней для поддельного продукта.
Ниже приведены результаты электрофореза SDS Page.
Пятна на изображении выше показывают, что только правильный продукт имеет такое же пятнышко в нужном месте на картинке, но на поддельном продукте есть маленькие пятнышки, что означает, что молекулярная масса едва видна.
Молекулярная масса бромелаина составляет около 33000, а молекулярная масса папаина — 21000. Хроматограмма ВЭЖХ:
Вы увидите, что только правильный экстракт содержит бромелайн с правильной молекулярной массой и обнаруживается с помощью ВЭЖХ.
Но если мы тестировали только с помощью аналитического метода установки для расщепления желатина (GDU), см. Приложение II. И правильный, и ложный продукт имеют одинаковые результаты, как показано ниже:
Стебель ананаса очень дешев, а скорость от стебля до бромелайна очень низкая, в производственном процессе есть некоторые загрязнения.
Почти все заводы по производству порошка фермента бромелайна находятся в непосредственной близости. Они используют свежий стебель. Невозможно отправить стебель на большое расстояние. С сырьем следует обращаться как можно скорее, когда оно собрано с поля, или его следует хранить в условиях низкой температуры (4-8 градусов), чтобы избежать деградации белка. В реальной жизни производитель фактически не может выполнить ни одно из двух вышеперечисленных условий из-за слишком большого количества стеблей ананасов. Разумным методом является баланс между временем обработки и потерей белковой активности. Обычно сырое сырье производят в сезон сбора урожая ананасов и хранят сырое сырье в условиях низкой температуры (4-8 градусов).
Мы проводим некоторые испытания электрофореза SDS Page. Теоретически мы можем увеличить его до 10000 или 20000. Но это будет очень дорого. 5000GDU / г и сделать его стабильным, возможно, на мальто-подложке / микроинкапсулированном или чем-то еще, плюс экстракция / очистка органического класса.
Приложение I
● Метод 5 Электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН (SDS-PAGE)
SDS-PAGE представляет собой метод электрофореза в денатурированном полиакриламидном геле. Принцип разделения белков в этом методе основан на том, что большинство белков могут соединяться с анионным поверхностно-активным веществом додецилсульфатом натрия (ДСН) в весовом соотношении с образованием комплекса
Отрицательный заряд, переносимый белковыми молекулами, намного превышает суммарный заряд природных белковых молекул, устраняя эффект заряда различных белковых молекул и разделяя белки в соответствии с их молекулярным размером.
Этот метод используется для качественной идентификации, контроля чистоты и примесей и количественного определения белков.
1 инструментальное устройство
Источник питания постоянного напряжения или постоянного тока, резервуар для электрофореза с вертикальной пластиной и форма для изготовления клея.
2. Реагенты
(1) Вода.
(2) Разделительный гель-буфер (4x, раствор А) 1,5 моль/л тригидроксиметиламинометан-хлористоводородная кислота буфера. Взвесьте 18,15 г тригидроксиметиламинометана и растворите его в соответствующем количестве воды. Доведите значение pH до 88 с помощью соляной кислоты и разбавьте до 100 мл водой.
(3) Взвесить 58,0 г акриламида и 20 г N,N'-метиленбисакриламида в 30-процентном растворе акриламида (раствор B), растворить в теплой воде и довести до 200 мл, профильтровать фильтровальной бумагой (хранится в темный).
(4) Взвесьте 10 г додецилсульфата натрия в 10-процентном растворе SDS (раствор C), растворите в воде и разбавьте до 100 мл.
(5) Реагент для коммерциализации раствора тетраметилэтилендиамина (TEMED, раствор D).
10-процентный раствор персульфата аммония (раствор E) Взвесьте 10 г персульфата аммония, растворите в воде и доведите до 100 мл. Рекомендуется подготовить его перед использованием или хранить отдельно при -20 градусах в течение 2 недель.
(7) Концентрированный каучуковый буфер (4 × раствор F) 0,5 моль/л Тригидроксиметиламинометан Буфер соляной кислоты, взвесьте 6,05 г тригидроксиметиламинометана, добавьте соответствующее количество воды для растворения, доведите значение pH до 6,8 с помощью соляной кислоты. кислоты и разбавить водой до 100 мл.
(8) Буфер для электродов (10 ×). Взвесьте 30 г триметиламинометана, 144 г глицина и 10 г додецилсульфата натрия, растворите их в воде и разбавьте примерно до 800 мл. Отрегулируйте значение pH до 8,1-8,8 с помощью соляной кислоты и разбавьте до 1000 мл водой.
(9) Невосстановленный буфер для образцов (4 ×). Взвесьте 303 г триметиламинометана, 20 мг бромфенолового синего и 8,0 г додецилсульфата натрия, отмерьте 40 мл глицерина, растворите в воде и разбавьте примерно до 80 мл. Доведите рН до 68 соляной кислотой и разбавьте до 100 мл водой.
(8) Буфер для электродов (10 ×). Взвесьте 30 г триметиламинометана, 144 г глицина и 10 г додецилсульфата натрия, растворите в воде и разбавьте примерно до 800 мл. Отрегулируйте значение DH до 81-88 с помощью соляной кислоты и разбавьте до 1000 мл водой.
(9) Невосстановленный буфер для образцов (4 ×). Взвесьте 3,03 г триметиламинометана, 20 мг бромфенолового синего и 80 г додецилсульфата натрия, отмерьте 40 мл глицерина, растворите в воде и разбавьте примерно до 80 мл. Доведите рН до 6,8 соляной кислотой и разбавьте до 100 мл водой.
(10) Восстановленный буфер испытуемого вещества (4 ×) Взвесьте 3,03 г триметиламинометана, 20 мг бромфенолового синего и 80 г додецилсульфата натрия, отмерьте 40 мл глицерина, растворите и разбавьте водой примерно до 80 мл и добавьте - 20мл меркаптоэтанола, с помощью соляной кислоты доводят pH до 6,8, разбавляют водой до 100 мл (или 3,03 г триметиламинометана, 20 мг бромфенолового синего, 8,0 г додецилсульфата натрия, отмеряют 40 мл глицерина, растворяют в воде и разбавляют до 80 мл, доводят pH до 6,8 с помощью соляной кислоты, разбавляют водой до 100 мл и перед использованием добавляют дитиотреитол до 100 ммоль/л).
● Приложение II
Аналитический метод установки для расщепления желатина (GDU)
A. Цель: Эта процедура используется для определения протеолитической активности ферментного порошка бромелайна.
Б. Оборудование:
1. рН-метр
2. Водяная баня с постоянной температурой 45,0 градусов ± 0,1 градуса
3. Аналитический баланс
4. Мерные колбы
5. Пипетки мерные
6. Таймер
7. Цифровая бюретка (точность 0,1 мл)
8. Вытяжной шкаф
9. Автоматические пипетки
C. Меры предосторожности:
Это испытание должно проводиться в вытяжном шкафу.
1. Используйте стандартные методы безопасности в лаборатории.
2. Формальдегид: подготовьте и всегда держите в вытяжном шкафу. Известный канцероген и тератоген.
3. Перекись: сильный окислитель
D. Реагенты и препараты реагентов:
1. Дистиллированная вода: приблизительно 500 мл: довести pH до 4,5 с помощью 0,1 N HCl.
2. Желатиновый субстрат:
а. 25 г желатина (Микробиология. 1.04070) растворить в 375 мл горячей воды, довести до кипения. Охладить до 45 градусов.
б. Доводят рН до 4,5 с помощью 0,1 N HCl и разбавляют до 500 мл дистиллированной воды с рН 4,5.
в. Держите желатиновую подложку при температуре 45 градусов.
3. Буферный раствор:
а. Медленно добавьте 15 г NaCl в 40-50 мл воды в стакане на 150 мл и перемешайте до растворения.
б. Добавьте 0,570 мл уксусной кислоты.
в. Отрегулируйте pH до 4,5 с помощью 0.2N HCL (объем будет больше 100 мл).
4. 3-процентная перекись водорода:
а. Пипеткой внесите 2,5 мл 30-процентного раствора перекиси водорода (исходный раствор) в мерную колбу на 25 мл и доведите до нужного объема дистиллированной водой с pH 4,5.
5. 37-процентный формальдегид, pH 9.0: a. Доведите достаточный объем (100 мл) формальдегида до pH 9,0 с помощью 0,1 N NaOH (примерно 20 мл формальдегида на образец до регулировки pH).
Аналитический метод установки для расщепления желатина (GDU) - продолжение.
6. 0.100 N NaOH: (приобретенный стандартизированный) a. Исходный раствор: стандартизирован на 0,100 Н
Е. Процедура:
1. Подготовка фермента:
а. Расчет препарата фермента
Вес {{0}}/целевая активность (приблизительно 0,05 г или 50 мг)
A. Точно взвесьте фермент в мерной колбе на 50 мл.
B. Добавьте 8,3 мл буферного раствора.
б. Дать постоять 30 минут при комнатной температуре.
C. Разбавьте до 50 мл, используя дистиллированную воду с pH 4,5, добавьте небольшую мешалку и перемешивайте еще 10–15 минут.
2. Ферментная процедура:
а. Пипеткой внесите по 25 мл желатинового субстрата в каждый из двух 100-мл стаканов с мешалками и поместите их на водяную баню при 45° на 5 минут, один для тестового раствора, а другой для контрольного раствора.
б. Тестовое решение:
1) Добавьте 1,0 мл раствора порошка фермента бромелаина в химический стакан, предназначенный для тестового раствора, запустите отсчет времени и перемешайте.
2) После ровно 20 минут инкубации при 45°С добавьте 0,1 мл 3-процентной перекиси водорода и перемешайте.
3) Инкубируйте еще 5 минут.
4) Снимите химический стакан с водяной бани и при постоянном помешивании вставьте pH-зонд.
5) Запишите pH через 10 секунд (начальный pH).
6) Доведите pH до 6,0 с помощью 0,1 N NaOH. (примерно 2-4 мл)
*Примечание. При корректировке pH до 6.0 будьте осторожны при pH 5,8; pH увеличивается медленно, и небольшое добавление NaOH в этот момент значительно повысит pH.
7) Продолжая постоянно перемешивать, добавьте 10 мл 37-процентного формальдегида pH 9,0.
8) Запишите значение pH через 10 секунд и 1 минуту.
9) Титруйте до pH 9,0 с помощью 0,1 N NaOH.
10) Запишите объем титрования.
Это тестовый титр, Т. с.
Пустое решение: Пустое решение следует запускать одновременно с тестовым решением. Это достигается запуском определения холостого раствора через 12 минут после запуска тестового раствора. Это дает вам время для завершения анализа тестового раствора, прежде чем переходить к пустому раствору. 1) Добавьте 0,1 мл 3-процентной перекиси водорода в химический стакан, предназначенный для контрольного раствора, и перемешайте.
2) Ровно через 20 минуты инкубации при 45° добавьте 1,0 мл раствора бромелаина и перемешайте.
3) Инкубируйте еще 5 минут.
АНАЛИТИЧЕСКИЙ МЕТОД НА УСТАНОВКЕ ДЛЯ РАСПЫЛЕНИЯ ЖЕЛАТИНА (GDU) - продолжение.
4) Снимите химический стакан с водяной бани и при постоянном помешивании вставьте pH-зонд.
5) Запишите pH через 10 секунд (начальный pH).
6) Доведите pH до 6,0 с помощью 0,1 N NaOH. (Приблизительно 2-4 мл)* См. примечание выше.
7) Продолжая постоянно перемешивать, добавьте 10 мл 37-процентного формальдегида pH 9,0.
8) Запишите значение pH через 10 секунд и 1 минуту.
9) Титруйте до pH 9,0 с помощью 0,1 N NaOH.
10) Запишите объем титрования. Это чистый титр, B.
F. Расчет:
1. Определение: Одна единица расщепления желатина – это такое количество фермента, которое высвобождает после 20-минутного расщепления при 45°С 1 мг аминного азота из стандартного раствора желатина при pH 4,5 или pH 5,5 (GDU pH 4,5 или pH 5,5).
GDU/г {{0}} (TB) x 14 x N x 50 Wt (г) Где: T=Тестовый титр (мл 0.1 N NaOH) B=Пустой титр (мл 0,1 N NaOH) N=Нормальность стандартизированного NaOH (т.е. 0,100) Масса (г)=Исходная масса фермента
G. Параметры тестирования:
1. Ферментные препараты разбавляют до концентрации приблизительно 0.001 г/мл (1 мг/мл) или порошкового концентрата фермента бромелаина приблизительно 1-2 GDU/мл. Эталонный материал анализируется при каждом запуске для обеспечения точности метода.
Компания Guanjie поставляет сыпучий порошок бромелайна с использованием метода испытаний GDU. Наш производственный процесс осуществляется в стандартных цехах CGMP с использованием трех производственных линий на двух заводах и двух независимых лабораториях. По любым вопросам относительно нашей продукции, пожалуйста, свяжитесь с нами по адресуinfo@gybiotech.com.
